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Tecnologia TRPS utilizzata per caratterizzare nanoparticelle lipidiche impiegate in una terapia per COVID-19

Notizia

Data di pubblicazione:

Venerdì 24 Giugno 2022

In linea con la continua necessità di una terapia mirata contro SARS-CoV-2, Idris et al. (2021) descrivono lo sviluppo di una terapia nanoparticelle-siRNA contro SARS-CoV-2.

I vaccini SARS-CoV-2 sviluppati da Pfizer e Moderna contengono mRNA, incapsulato per il rilascio di nanoparticelle lipidiche (LNP). Questi vaccini non solo hanno ridotto l'impatto del COVID-19 per miliardi di persone in tutto il mondo, rappresentano anche una nuova entusiasmante era per la nanomedicina.

L'uso delle tecnologie LNP offre un percorso versatile e scalabile per lo sviluppo di varie terapie; fornisce una piattaforma stabile e relativamente sicura per la somministrazione di farmaci. Nel lavoro sopracitato, pubblicato sulla rivista Molecular Therapy, gli autori descrivono lo sviluppo e lo screening di nuove formulazioni di LNP per il rilascio di RNA interferente breve (siRNA) contro il SARS-CoV-2. In questo caso, è stata utilizzata la tecnologia TRPS (Tunable Resistive Pulse Sensing) per ottenere un quadro ad alta risoluzione della distribuzione dimensionale delle nanoparticelle preparate.

L'articolo, intitolato " SARS-CoV-2 targeted siRNA-nanoparticle therapy for COVID-19", è scritto da ricercatori provenienti da diversi istituti nel Queensland, in Australia (Griffith University, University of Queensland) e dagli Stati Uniti (un centro di ricerca sulla terapia genica in California). ¹

Esame dello small interfering RNA

I siRNA, a volte noti come RNA silenziante, sono una classe di RNA a doppio filamento utilizzati nella ricerca per ridurre l'espressione di specifici geni. siRNA può essere prodotto in vari modi e crea effetti di silenziamento genico legandosi a un complesso che porta alla scissione specifica della sequenza dell'RNA bersaglio.²

Per trovare siRNA che potessero prendere di mira il SARS-CoV-2, è stato utilizzato un approccio bioinformatico, al fine di esplorare:

Caratteristiche strutturali del genoma dell'RNA SARS-CoV-2
Conservazione della sequenza
Modifiche dell'RNA
L'assenza di seed sequence nel trascrittoma umano (per garantire che l'RNA umano non fosse preso di mira)

Tra le migliaia di siRNA candidati valutati, sono stati selezionati 18 siRNA per studi volti a valutare gli effetti repressivi sull'espressione del virus in vitro.

Infine tre candidati sono stati selezionati per la formulazione successiva e per studi funzionali in vivo. Questi siRNA sono stati mirati a tre aree specifiche e altamente conservate di SARS-CoV-2:

Le regioni ultraconservate nella RNA polimerasi RNA-dipendente (i virus a RNA codificano le proprie RNA polimerasi RNA-dipendenti per eseguire la replicazione e la trascrizione del genoma basate sull'RNA).³ L'RNA corrispondente è indicato come siUC7.
Helicase (una famiglia di proteine motorie che catalizzano lo svolgimento dei filamenti di acido nucleico, un componente critico della replicazione virale). L'RNA corrispondente è indicato come siHel1.
5′ UTR (svolge un ruolo importante nel controllo dell'efficienza della traduzione).⁴ L'RNA corrispondente è indicato come siUTR3.

SiRNA incapsulato in nanoparticelle lipidiche

Un nuovo sistema di rilascio di LNP è stato utilizzato per fornire i siRNA selezionati, da soli o in combinazione. L'obiettivo è riuscire a far arrivare queste formulazioni ai polmoni, data la nota fisiopatologia del COVID-19.

Per ottenere questo obiettivo, il gruppo di ricerca ha incorporato delle componenti che si sono dimostrate in grado di migliorare il targeting al polmone (1,2-dioleoil-3-trimetilammonio-propano, DOTAP; DLin-MC3-DMA, MC3), indicati collettivamente come dmLNP - formulazioni di siRNA.

Come parte del processo di caratterizzazione, il qNano Gold di Izon (lo strumento TRPS che ha preceduto l'Exoid) è stato utilizzato per misurare la distribuzione granulometrica degli LNP dmLNP-siRNA. È stato utilizzato un nanoporo consumabile NP150, adatto alla misurazione di particelle di dimensioni comprese tra 70 e 420 nm (Figura 3B nella pubblicazione).

Rispetto ad altre tecniche ensemble, la TRPS è particolarmente adatta all'analisi di nanoparticelle per applicazioni terapeutiche in quanto fornisce informazioni precise e ad alta risoluzione, a livello di singola particella.

Effetti repressivi delle funzionalità riscontrati nei topi

Idris et al. (2021) hanno scelto di percorrere una via di somministrazione endovenosa, motivata dal fatto che lo strato spesso mucosa che può accumularsi nel polmone durante COVID-19 può impedire l'uso di terapie aerolizzate.

Gli LNP di nuova formulazione sono stati confrontati con gli LNP formulati in precedenza; la localizzazione di LNP marcati in modo fluorescente in vari organi è stata oggetto di verifica 24 ore dopo la somministrazione.

Gli effetti in vivo sono stati misurati tramite un test della placca virale: determinazione del numero di copie virali, analisi dell'espressione genica, nonché misure della perdita di peso, e un punteggio clinico basato su locomozione, comportamento e aspetto.

Le nanoparticelle lipidiche di siRNA rappresentano una promettente terapia aggiuntiva alle attuali strategie vaccinali

Nel complesso, i risultati indicano una potente e dose-dipendente repressione dell'espressione del virus, quando i siRNA sono stati somministrati da soli o in combinazione. Maggiore probabilità di sopravvivenza è stata osservata nei topi trattati con sLNP-siUC7 e sLNP-siHel2 infetti da virus, e nei topi trattati con controllo sLNP-siRNA.

La repressione di SARS-CoV-2 ha avuto effetto transitorio, con una durata di circa 48 ore. Per superare questo effetto non permanente, gli sviluppi futuri possono includere un regime giornaliero per via endovenosa durante il picco di infezione virale.

Questo studio apre la strada allo sviluppo basato su LNP. Come approccio che prende di mira le regioni altamente conservate nel genoma del virus, i siRNA-LNP sono una promettente terapia che potrebbe essere efficace su più varianti; la TRPS è uno strumento prezioso in grado di fornire approfondimenti precisi su una singola particella e sulle caratteristiche fisiche degli LNP durante la fase di ricerca e sviluppo.

Gli autori concludono: "Sebbene sia le tecnologie RNAi che LNP siano relativamente nuove, sta diventando evidente che questa tecnologia di nuova generazione è programmabile, scalabile, stabile e relativamente sicura; ha molto da offrire come terapia per colpire in modo specifico SARS-CoV-2 e curare la malattia COVID-19".

Fonti/Riferimenti

Idris A, Davis A, Supramaniam A, et al. A SARS-CoV-2 targeted siRNA-nanoparticle therapy for COVID-19. Molecular Therapy. 2021;29(7). doi:10.1016/j.ymthe.2021.05.004

Neumeier J, Meister G. siRNA Specificity: RNAi Mechanisms and Strategies to Reduce Off-Target Effects. Frontiers in Plant Science. 2021;11(526455). doi:10.3389/fpls.2020.526455

Shu B, Gong P. Structural basis of viral RNA-dependent RNA polymerase catalysis and translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2016;113(28):E4005-E4014. doi:10.1073/pnas.1602591113

Vankadari N, Jeyasankar NN, Lopes WJ. Structure of the SARS-CoV-2 Nsp1/5′-Untranslated Region Complex and Implications for Potential Therapeutic Targets, a Vaccine, and Virulence. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2020;11(22):9659-9668. doi:10.1021/acs.jpclett.0c02818