Cefalopodi e Olotomografia di Tomocube: nuova sonda molecolare

I cambiamenti di colore e iridescenza apparentemente facili e istantanei visibili su polipi, calamari e seppie, sono uno dei fenomeni più sorprendenti della natura. Recentemente è stato scoperto come utilizzare le proteine riflettine dei cefalopodi responsabili di questi cambiamenti per manipolare l'indice di rifrazione ottica (IR) dei compartimenti cellulari dei mammiferi.

Modificando questa proprietà fisica intrinseca della cellula, è possibile utilizzare i valori dell’ IR come sonde molecolari nell’acquisizione di immagini ottiche delle cellule senza l’uso di marcatori fluorescenti utilizzando il microscopio olotomografico di Tomocube.

Gerald M Pao (1) e i suoi colleghi del Salk Institute for Biological Studies in California hanno mostrato come trasformare la cellula stessa in una sonda molecolare per l'imaging in fase quantitativa: hanno manipolato geneticamente l'IR delle cellule viventi sintetizzando i geni della riflettina dei cefalopodi come Sepioteuthis lessoniana e Miura peninsula Shiro-ecotype, e clonando nuovi geni della riflettina ottenendo un valore dell’IR elevato per il reticolo endoplasmatico (ER) delle cellule.

Un epitopo contrassegnato per il riconoscimento degli anticorpi con un tag HA o FLAG, con l’aggiunta di una sequenza di preprotripsina per indirizzare la proteina nella via secretoria, un segnale di ritenzione ER KDEL C-terminale è stato aggiunto per indirizzare specificamente il reticolo endoplasmatico (ER) delle cellule. Il successo di questa manipolazione è dimostrato grazie agli studi condotti con la microscopia quantitativa olotomografica di Tomocube, in grado di misurare valori dell’aumento dell’IR fino a 1,4, ben al di sopra dell'IR del reticolo endoplasmatico di 1,35.

Le proteine reflectine sono i principali componenti responsabili della colorazione strutturale e dell'iridescenza nei cefalopodi, utilizzati principalmente per il loro camouflage. Esse si trovano in cellule specializzate, gli iridofori, che formano specchi di Bragg alternando strati di materiale ad alto e basso indice di rifrazione.

All'interno degli stack di membrana, le riflettine formano nanoparticelle da <5 nm a> 500 nm e conferiscono agli iridofori la proprietà di alto indice di rifrazione ottico. Le reflectine sono anche utilizzate dai cefalopodi per la diffusione della luce bianca e per ottenere l'invarianza cromatica dei cromatofori, sacche di pigmento, quando questi si espandono o si contraggono.

Il microscopio olotomografico Tomocube combinando l'approccio QPI (Quantitative Phase Imaging) alla tomografia fornisce immagini 3-D quantitative, di singole cellule in vivo, con risoluzione scala nanometrica, in tempo reale, senza l’uso di marcatori, in modo rapido e semplice senza alcuna complessa preparazione del campione. Le immagini olotomografiche forniscono informazioni quantitativo su proprietà cellulari vitali uniche, tra cui volume cellulare, forme di organelli subcellulari, densità citoplasmatica, area superficiale e deformabilità.

Vincitore del premio Innovazione Microscopy Today 2019, questo microscopio consente il monitoraggio a lungo termine di target specifici nelle cellule vive riducendo al minimo lo stress. La capacità di fornire facilmente olotomografia e analisi correlativa della fluorescenza in 2D, 3D e 4D consentirà a ricercatori e medici di aprire nuove frontiere nella bioscienza e comprendere, diagnosticare e trattare meglio le malattie.