Vescicole extracellulari e ricerca sul Glioblastoma: un approfondimento sul campo

Come parte della loro ricerca sugli indicatori intra ed extracellulari del GBM, il gruppo ha sviluppato un particolare interesse per una sottopopolazione di cellule chiamate cellule staminali del glioblastoma (GSC).

Le GSC sono considerate agenti promotori della formazione e della progressione del glioblastoma e sono anche associate alla resistenza alla terapia nel GBM.⁵ Comprendere e sfruttare gli aspetti dei GSC, quindi, rappresenta una potenziale via da seguire per lo sviluppo di test e trattamenti diagnostici per il GBM. Pertanto c'è un grande interesse nello scoprire come le GSC interagiscono tra loro, nell'investigare il loro microambiente che promuove l'aggressività del GBM e la resistenza al trattamento.

Sebbene i meccanismi precisi siano ancora in fase di studio, le vescicole extracellulari sono state identificate quali componenti critici della comunicazione cellulare e della fisiopatologia – e il GBM non fa eccezione.^6-8 Sono stati identificati diversi meccanismi potenziali; per esempio, le GSC secernono il fattore VEGF-A proangiogenico negli EV,⁹ e gli EV che trasportano microRNA specifici secondo quanto riferito mirano a RhoB e riducono l'apoptosi in vivo e in vitro.¹⁰

Per esplorare potenziali meccanismi di resistenza, il team ha ottenuto cellule staminali da resezioni tumorali di glioblastoma e le ha coltivate in presenza o assenza di temozolomide, un agente chemioterapico.¹¹ In linea con l'osservazione che la temozolomide può incontrare resistenza da parte di alcuni tumori, il chemioterapico era appena tossico per le colture sferoidi di cellule staminali di glioblastoma derivate dal paziente. È interessante notare che l'analisi tramite Tunable Resistive Pulse Sensing (TRPS) del mezzo di coltura cellulare ha dimostrato che le concentrazioni di EV erano elevate quando le GSC venivano trattate con temozolomide, nonostante la temozolomide non avesse alcun effetto sulla vitalità cellulare. Un'ulteriore analisi delle vescicole extracellulari da GSC resistenti alla temozolomide derivate dal paziente ha svelato un arricchimento di vescicole extracellulari con carichi dedicati alle vie di adesione cellulare, aprendo la strada a nuove prospettive sul ruolo delle vescicole extracellulari nella chemioresistenza alla temozolomide e alla recidiva del tumore GBM.

Con l'accesso ai campioni dei pazienti e ai modelli murini GBM, l'isolamento delle vescicole extracellulari è un aspetto importante del lavoro del gruppo. Il plasma contiene lipoproteine ​​e altri aggregati proteici che alterano gli studi sulla quantificazione e sul contenuto di EV. Per ottenere dati di alta qualità, quindi, è necessario prestare attenzione per garantire che i campioni siano sufficientemente purificati prima dell'analisi EV. Quando si lavora con il plasma, Gwennan utilizza le colonne qEV di Izon per separare i contaminanti solubili. Le colonne sfruttano i principi della cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e consentono la raccolta rapida (<15 minuti) di volumi di raccolta purificati contenenti EV intatte.

Per standardizzare la raccolta dei volumi di campioni purificati, il gruppo utilizza l'Automatic Fraction Collector (AFC) di Izon. L'AFC può essere programmato per raccogliere un volume di fluido desiderato nei tubi di raccolta che sono tenuti da un carosello integrato, consentendo all'operatore di occuparsi di altro nel frattempo, e garantendo una ridotta variabilità intra-operatore. La dott.ssa Gwennan ritiene che l'AFC possa essere un importante strumento da banco nella clinica una volta identificato un biomarcatore e stabilito un protocollo affidabile per la diagnosi di GBM basata su EV: "Utilizziamo il collettore automatico di frazioni qEV per standardizzare la procedura. Lo troviamo molto facile da usare e ci piace dire ai medici che se un giorno troveremo un biomarcatore, allora avremo già uno strumento disponibile", afferma la dott.ssa Gwennan.

Una volta ottenuti i volumi di raccolta purificati, le particelle vengono identificate utilizzando i marcatori di superficie CD9, CD63 e CD81, nonché le proteine ​​EV interne, come Alix e HSP70. La tecnologia TRPS di Izon viene utilizzata per le misurazioni delle dimensioni e della concentrazione, poiché il gruppo ha scoperto che questa tecnica è una soluzione accurata per la caratterizzazione delle vescicole extracellulari. Il dottor André-Grégoire sottolinea la necessità di una necessaria formazione come fattore importante per ottenere risultati di qualità.