HSI - Microscopio Iperspettrale

Visible Near Infrared (VNIR) e Short Wave Infrared (SWIR)

La tecnologia di microscopia iperspettrale sviluppata da CytoViva è stata creata in maniera specifica per la caratterizzazione spettrale e la mappatura spettrale di campioni su scala nanometrica, ripresi con il microscopio in campo scuro brevettato da Cytoviva. Questa tecnologia di imaging iperspettrale supporta inoltre un'ampia gamma di tipologie di campioni, anche di dimensioni micro- e macro-metriche.

Le immagini del microscopio iperspettrale appaiono molto simili a un'immagine del microscopio ottico tradizionale, ma con un'importante differenza. Ogni pixel di un'immagine iperspettrale fornisce la risposta spettrale di riflettanza completa dell'area spaziale del pixel stesso, all'interno dell'intervallo spettrale VNIR o SWIR. Ciò consente misurazioni spettrali non distruttive di elementi su scala nanometrica nel contesto spaziale completo dell'immagine del campione.

Con un ingrandimento di 100x, un'immagine del microscopio iperspettrale può contenere fino a 700.000 pixel, ciascuno fino a 128 nm. Questi dati iperspettrali sono registrati a circa 2 nm di risoluzione spettrale nell'intervallo VNIR, consentendo di misurare le minime differenze spettrali da pixel a pixel all'interno dell'immagine.

Le immagini del microscopio iperspettrale possono essere catturate da campioni nella nanoscala sia biologici che materiali. Questi oggetti su scala nanometrica possono essere integrati in un'ampia gamma di ambienti biologici o materiali. Tra le immagini in alto un esempio di AuNPs nel tessuto linfonodale ex vivo. In questo esempio, l'imaging iperspettrale consente di identificare e mappare rapidamente gli AuNP presenti nel tessuto e fornisce una distribuzione di classe che conferma l'area totale in cui sono presenti gli AuNP.

Queste immagini iperspettrali vengono create in modalità scansione lineare o "pushbroom", spostando il campione attraverso il campo visivo del microscopio e dello spettrografo tramite il tavolino traslazionale automatizzato del microscopio. In genere queste immagini iperspettrali  vengono create in secondi o minuti, a seconda dell'esposizione richiesta. I componenti per il sistema di imaging iperspettrale basato su microscopia comprendono una fonte di luce dedicata, un tavolino traslazionale automatizzato, uno spettrografo con reticole a diffrazione per trasmissione e una camera. Questi componenti sono integrati per interagire con il software di acquisizione e analisi delle immagini altamente funzionali. Il software proprietario offre la possibilità di confrontare gli spettri all'interno di un'immagine campione o tra un numero elevato di campioni. Il software può anche elaborare una libreria spettrale di elementi unici derivati da campioni e, utilizzando questa libreria spettrale, questi elementi possono essere mappati in esami successivi. L'imaging iperspettrale CytoViva può essere acquisito sia nelle lunghezze d'onda del visibile vicino infrarosso (VNIR 400 nm - 1.000 nm) che nelle lunghezze d'onda dell'infrarosso a onde corte (SWIR 900 nm - 1700 nm). Qui sotto l'immagine di una , che non richiedono l'imaging tramite microscopia.Configurazione di sistema per l'imaging iperspettrale di campioni su macro-scala 

Il sistema di illuminazione in campo scuro (brevettato), consente di convogliare sul piano focale una quantità di luce 100 volte superiore rispetto alla microscopia in campo oscuro convenzionale.

Di conseguenza il rapporto segnale-rumore risulta il più alto ottenibile in microscopia ottica in campo scuro allo stato dell'arte.

La combinazione con uno spettrografo VNIR consente l'analisi spettrale quantitativa sulla nanoscala di materiale biologico, o materiali tecnici, sia che siano isolati, ovvero che si trovino dentro ad una cellula, in un tessuto od in altre matrici complesse.

Video

Microscopio iperspettrale in campo oscuro potenziato CytoViva: video introduttivo
Microscopia in campo scuro 3D potenziata by Cytoviva: webinar
CytoViva 3D Imaging potenziato in campo scuro: rilascio di nanoparticelle d'oro da farmaco chemo in cellula
Diffusione di particelle micro e nano in radice di capello viva, ripresa utilizzando la microscopia in campo scuro Cytoviva
Le caratteristiche chiave del microscopio iper-spettrale Cytoviva
  • La possibilità di visualizzare nano-materiali senza utilizzare marcatori di fluorescenza o particolari metodi di preparazione.
  • Identificazione spettrale (range spettrale: 400nm - 1.000nm) e caratterizzazione di nano-materiali
  • Disponibilità di librerie spettrali di nanoparticelle pure, che consentono l'identificazione di nanoparticelle in matrici complesse, e la loro localizzazione senza ambiguità
  • Disponibilità di una camera con controllo ambientale per studi di lunga durata su cellule vive
  • Imaging simultaneo ed in tempo reale di porzioni fluorescenti, e, rispettivamente, non-fluorescenti del campione
  • Si presta ad applicazioni quali: mapping di nanoparticelle dentro a tessuti, drug-delivery, nano-tossicità, identificazione di patogeni, ecc.  
Traslazione della slide con il campione

La copertura dell'intera area del campione viene ottenuta traslando il vetrino del campione di piccoli incrementi lungo una unica direzione tramite lo stadio motorizzato. Questo movimento porta le aree adiacenti del campione all'altezza dell'obiettivo, dove viene registrata un'immagine spettrale. Ogni registrazione copre una linea sottile e parallela orizzontalmente al mirino dell'obiettivo, e contiene lo spettro di ogni punto lungo la linea. Ripetendo questo movimento, vengono acquisiti gli spettri da un'area bidimensionale del campione. Questo processo è noto come "scansione iperspettrale pushbroom" e consente di acquisire sia l'immagine del campione che il suo spettro da ogni punto dell'immagine, come un cubo di dati iperspettrali. Le dimensioni del cubo comprendono le dimensioni X e Y dell'area spaziale e i dati spettrali associati a ciascun pixel dell'immagine.

Acquisizione Dati
Con riferimento all'immagine qui sopra (sulla sinistra della stess), come si vede dall'oculare, il microscopio è focalizzato su un gruppo di cellule che sono state incubate con nanoparticelle. Alcune delle particelle non sono a fuoco (cerchi grandi) e altre sembrano a fuoco, dentro la cellula. Il cubo di dati iperspettrale viene scansionato dall'area all'interno del riquadro rosso. Il movimento della diapositiva fa muovere le linee di scansione dall'alto verso il basso del riquadro. Le linee di scansione blu e verde mostrate nella stessa immagine (contrassegnate dai numeri 1 e 2 lungo la direzione Y) intersecano due nanoparticelle che erano all'interno della cella.
 
Ad ogni riga il sistema acquisisce un'immagine digitale che contiene gli spettri di tutti i punti nella direzione X. Sulla destra si vedono le immagini spettrali scattate sulle linee blu e verde. Sono visibili spettri della  nanoparticella più brillante e della struttura delle cellule più deboli. Queste due immagini appartengono al set completo di diverse centinaia di linee che finiranno per formare il cubo di dati iperspettrale.
Analisi dei Dati
Cubo di dati iperspettrale e spettri delle nanoparticelle
Cubo di dati iperspettrale e spettri delle nanoparticelle

Una volta completata la scansione, il software CytoViva-ENVI apre il cubo di dati (immagine qui sopra, sulla sinistra). Il cubo di dati è una ricreazione RGB basata sull'intensità spettrale di ciascun pixel. Sulla destra dell'immagine, si osservano i plot degli spettri delle due nanoparticelle, a seguito del click effettuato sui pixel che si sovrappongono alle loro posizioni. Gli spettri di tutti i punti dell'immagine sono analizzabili in maniera analoga. Questi spettri possono quindi essere esportati per ulteriori analisi o salvati come librerie spettrali.